武汉供卵代孕性别选择_稳了！老司机手把手教你做RT-qPCR最美曲线：标准曲线如

RT-qPCR操作简单效率高，全国多家诊断试剂、临床研究类客户都在使用。本文将从反应效率、灵敏度和可重复性三方面评估标准曲线，并为大家介绍实时荧光定量PCR四方面常见困难。

一、RT-qPCR是什么？

实时荧光定量PCR（quantitative Real-time PCR）是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，运用Taq酶的5′-3′外切酶活性和荧光能量传递技术，把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，对整个PCR反应扩增过程进行了实时监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，监测到的荧光信号随反应变化可以绘制成一条曲线，最后通过标准曲线对未知核酸模板进行定量分析的方法。

图1：图片来源于网络，若有侵权联系删除

RT-qPCR反应由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成，技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念--Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

在RT-qPCR中，对扩增过程进行实时监测，根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。

图2：图片来源于网络，若有侵权联系删除

整条曲线可以分为3个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，所以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，由此来推断模板最初的含量而进行定量分析。

二、TaqMan荧光探针、SYBR荧光染料

RT-qPCR反应所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：

1、TaqMan荧光探针

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

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探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。

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即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。

2、SYBR荧光染料

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

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三、采用标准曲线评估反应效率、灵敏度和可重复性

1、反应效率

反应效率的最佳评估方法是生成标准曲线。

通过构建连续稀释的样本核酸，并进行实时荧光定量PCR，生成标准曲线。然后以起始核酸量为X轴，以Ct为Y轴，绘制结果曲线。

用于生成标准曲线的样本 (尽可能接近) 应与将用于实验的样本匹配 (即相同的总 RNA 或 DNA 样本)。标准曲线分析的稀释范围或动态范围应涵盖实验样本预期的浓度范围。

曲线的斜率可用于测定反应效率，100%效率代表每个循环中的模板均实现了完美倍增，但大多数科学家认为反应效率应在90%至110%之间。

2、灵敏度和可重复性

效率在90–110%的理想窗口内的标准曲线确定了RT-qPCR反应可测量的起始模板量范围。某种程度上可通过靶点Ct在扩增曲线上出现的时间测定灵敏度。

但是，分析灵敏度的实际测量方法是特定少量的模板是否适用于标准曲线并维持理想的扩增效率。符合要求的稀释度最高的样本决定了反应灵敏度。

标准曲线还包括R2值，用于测量重复样本的可重复性。重复标准曲线以评估一致性，从而保持样本的数据准确度。武汉正规供卵医院

四、RT-qPCR四方面常见困难

RT-qPCR的常见困难可归结为四个主要方面：引物二聚体的形成、引物和探针的储存、实时荧光定量 PCR的抑制和较低的反应效率、软件分析设置。

图6：实时荧光定量PCR常见四方面困难

RT-qPCR反应应用：

1、感染性疾病检测

2、肿瘤基因检测

3、遗传病检测

五、凡知医学相关产品

1、Viral DNA/RNA Extraction Kit病毒DNA/RNA提取试剂盒

产品特点：

适用广泛：支持血清、血浆、尿液、CSF、拭子浸泡液、培养液上清等多种样本；

操作便捷：整个操作过程在25分钟之内可获得高质量DNA/RNA；

无污染：能够将污染物与PCR抑制剂彻底去除，保证下游实验；

高灵敏：能够成功提取病毒低拷贝数的核酸；

高效率：手提与高通量自动化提取仪均可适用；

2、Lysate2RT Kit直扩产品

本试剂盒采用特殊方法裂解培养细胞，无需RNA纯化即可从细胞裂解液直接实施定量RT-PCR。适用于TaqMan和SYBR Green方法基因定量。

产品特点：

无需RNA提取、纯化；

原味裂解，无需反复转移；

操作简单，无需提取仪；

有效的避免PCR抑制；

通量高，可同时处理96个样品；

优良的线性范围

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扩增曲线对照实验

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理想的重复性

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3、Firegen VMTM一次性病毒采样管

产品特性：

Firegen VMTM为非灭活型鼻/口咽拭子保存液，在4℃至室温区间保持细胞及病毒的完整性。

病毒RNA采集后在保存运输温度范围内不被降解。

采样灭活后的RNA在4℃保存1周稳定，Ct值无变化。

无须进行核酸提取，免去提取设备以及提取试剂，极大降低检测成本和检测耗时。

VMTM对RT-PCR无显著抑制作用，对检测反应无不良影响。

采样灭活后的采集管在4℃存放48h、72h后的效果检测：

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一次性病毒采样管-2.png

4、新型冠状病毒冻干检测试剂盒（实时荧光探针法）

产品特性：

全组份冻干技术，常温运输，无需冷链，比液体试剂更可靠；

创新采用单反应微球设计，极大简化操作流程；

将疫情防控迅速延伸至偏远地区和贫困地区，实现了病毒防控“全天候”作战。

一致性测试

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标准曲线

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关于凡知医学

凡知医学(FireGen Biomedicals)是一家全球化运营的生物医药企业，由拥有世界顶尖药企30年从业资历的海归科学家团队创立，针对重大疾病搭建有先进的新一代核酸快速诊断试剂和仪器研发平台，创新实现了基因测序试剂盒、快速基因检测仪和检测芯片的开发，助推基因快速诊断进入基层医疗体系，致力于打造中国领先的基因快速诊断品牌，提供一体化诊断的仪器、芯片、诊断试剂和部分高端原料。

参考文献：

[1]韦信贤,黎小正,童桂香,吴祥庆.实时荧光定量PCR技术及其在水生动物病毒病定量检测中的应用[J].水产科学,2010,29(11):681-687.